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实时荧光定量PCR技术中的几个重要概念

2021-10-15

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术是1985年面世的一项基因检测技能,是体外扩增核酸片段的基因检测技能,因为传统的 PCR 技能不能准确定量,并且在操作过程中容易遭到污染而出现假阳性,使其使用遭到很大的限制。


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X320全自动PCR分析系统设备



荧光定量 PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase ChainReaction,QPCR)技能完成了 PCR 从定性到定量的腾跃,以其快速、特异性强、重复性好、定量准确、可实时监测等优点成为了分子生物学研讨中的重要工具。


实时定量PCR技能不仅完成了对模板的定量,且具有灵敏度高、特异性和可靠性更好、自动化程度高和无污染的特色,使得荧光定量PCR逐渐取代常规PCR。 


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实时荧光定量PCR技能中有几个重要的概念,包含扩增曲线、基线、荧光阈值和域值循环数。


(1)扩增曲线(amplification curve): 是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号跟着循环数变化而制作的一条曲线。在进行PCR反应过程中,经过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测,最后将荧光信号值经过成像技能显现在计算机上。正常的扩增曲线包含四个阶段:基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。

(2)基线(baseline):是背景曲线的一段,在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大,接近一条直线。

(3)荧光阈值(threshold):是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度规范(即PCR扩增产品量的规范)。荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期。

(4)阈值循环数:表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所读的循环数,研讨表明,各模板的CT值与该模板的开始拷贝数的对数存在线性关系,即起始拷贝数越多,CT值越小;起始拷贝数越少,CT值越大。我们使用已知起始拷贝数的规范品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条规范曲线。只需获得未知模板的CT值,即从规范曲线上计算出该模板的开始拷贝数。
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